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无菌检查法-2015版中国药典


录入时间:2014-9-15 14:35:19 来源:国度药典委员会,新宝GG登录平台。

无菌检查法系用于检查药典请求恳求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种能否无菌的一种措施。若供试品适宜无菌检查法的轨则,新宝GG登录平台。仅注解了供试品在该检验条件下未发现微生物净化。
无菌检查应在环境洁净度B 级背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离体例中进行,防止净化的措施不得影响供试品中微生物的检出。新宝GG登录平台。单向流空气区、事务台面及环境应按期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试措施》的现行国度圭表进行洁净度确认。新宝GG登录平台。隔离体例应按期按相关的请求恳求进行考证,新宝GG代理。防止微生物净化,其全经过应庄严遵守无菌操作。
无菌检查人员必需具备微生物专业学问。
培养基
硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养,通常在3周内利用;若留存于密闭容器中,新宝GG登录平台。若留存于非密闭容器中,新宝GG总代。亦可利用按该处方临蓐的适宜轨则的脱水培养基。新宝GG登录平台。配制后应采用考证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应留存在2~25℃、避光的环境,也可用于需气菌培养;胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备。

1. 硫乙醇酸盐流体培养基
酪胨 (胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g
葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.无菌查抄法。5g
L-胱氨酸 0.5g 新配制的 0.1% 刃天青溶液 1.0ml
硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.75g
(或硫乙醇酸) ( 0.3 ml) 纯化水 1000ml

除葡萄糖和刃天青溶液外,并防止被净化。除另有轨则外,只限加热一次,2015版中国药典。迅速冷却,须经100℃水浴加热至粉红色消灭(不胜过20 分钟),否则,gg。培养基氧化层的高度不获胜过培养基深度的1/5,其装量与容器高度的比例应适宜培养结束后培2养基氧化层(粉红色)不胜过培养基深度的1/2。灭菌。登录。在供试品接种前,调度pH 值使灭菌后为7.1±0.平台。2。分装至适宜的容器中,摇匀,加入葡萄糖和刃天青溶液,滤清,煮沸,调度pH 为弱碱性,微温溶解,取上述成分混合。
2. 胰酪大豆胨液体培养基
胰酪胨 17.0g 氯化钠 5.无菌。0g
大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0g 磷酸氢二钾 2.5g
葡萄糖(一水合/无水) 2.5g (2.查抄。3g) 纯化水 1000mL
除葡萄糖外,分装,加入葡萄糖,调度pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为7.2015。3±0.2,滤过,微温溶解,混合,取上述成分。
3. 拔取性培养基
按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法,在培养基灭菌或利用前加入适宜的中和剂、灭活剂或外面活性剂。中国。
4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基(用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查)
胨 10.0g 氯化钠 5.0g
葡萄糖 5.0g 水 1000 ml
牛肉浸出粉 3.0g
除葡萄糖外,分装,调度 pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为7.2±0.2,国药。滤清,摇匀,加入葡萄糖溶解后,煮沸,调度 pH 为弱碱性,微温溶解,取上述成分混合。
5. 胰酪大豆胨琼脂培养基
胰酪胨 15.0g 氯化钠 5.药典。0g
大豆木瓜蛋白酶水解物 5.0g 琼脂 15.0g
纯化水 1000ml
除琼脂外,分装,摇匀,加热溶解后,新宝GG登录平台。加入琼脂,调度pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为7.3±0.2,混合。微温溶解,取上述成分。
6.沙氏葡萄糖液体培养基
植物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g
葡萄糖 20.0g 纯化水 1000mL
除葡萄糖外,分装,摇匀,加入葡萄糖,无菌查抄法。调度pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为5.6±0.2,微温溶解,混合,取上述成分。
7. 沙氏葡萄糖琼脂培养基
植物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g
葡萄糖 40.0g 纯化水 1000mL
琼脂 15.0g
除葡萄糖、琼脂外,分装,摇匀,加入琼脂,加热溶解后,2015版中国药典。 再加入葡萄糖,调度pH值使灭菌后在25℃的pH值为5.6±0.2,微温溶解,混合,取上述成分。
培养基的适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应适宜培养基的无菌性检查及灵敏度检查的请求恳求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。gg。,登录。
无菌性检查 每批培养基随机取不少于5 支(瓶),置各培养基轨则的温度培养14 天。平台。
灵敏度检查
菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不获胜过5 代(从菌种留存焦点取得的冷冻枯燥菌种为第0 代),并采用适宜的菌种留存技术进行留存。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)〔CMCC(B)63 501〕
生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕
红色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕
黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕
菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的稀罕培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上,采用适宜的措施吸出孢子悬液至无菌试管内,将孢子洗脱。然后,加入3~5ml 含0.05%(v/v)聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液,20~25℃培养5~7 天,上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于100CFU(菌落造成单位)的菌悬液。接种黑曲霉的稀罕培养 物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上,20~25℃培养24~48 小时,30~35℃培养18~24 小时;接种红色念珠菌的稀罕培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上,接种生孢梭菌的稀罕培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中。
菌悬液在室温下放置应在2 小时内利用,若留存在2~8℃可在24 小时内利用。黑曲霉孢子悬液可留存在2~8℃。
培养基接种 取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基7 支,另1 支不接种作为空白对照,培养3 天;取每管装量为9ml 的胰酪大豆胨液体培养基7 支,划分接种小于100CFU 的枯草芽孢杆菌、红色念珠菌、黑曲霉各2 支,另1 支不接种作为空白对照,划分接种小于100CFU 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2 支。
结果判定 空白对照拂应无菌生长,若加菌的培养基管均生长良好。
浓缩液、冲洗液及其制备措施
浓缩液、冲洗液配制后应采用考证合格的灭菌程序灭菌。
1.0.1%蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g,分装,调度pH 值至7.1±0.2,滤清,微温溶解,加水1000ml。
2.pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液 取磷酸二氢钾3.56g,分装,滤清,微温溶解,加水1000ml,蛋白胨1.0g,氯化钠4.30g,磷酸氢二钠7.23g。
3. 遵循供试品的特性。
如须要。
措施适用性实践
当进行产品无菌检查法时,以确认所采用的措施适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发作变化可能影响检验结果时,应进行措施适用性实践。
措施适用性实践按“供试品的无菌检查”的轨则及下列请求恳求进行操作。对每一实践菌应逐一进行措施确认。
菌种及菌液制备 除大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 4 4102〕外。
薄膜过滤法 取每种培养基轨则接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤,作为对照。置轨则温度培养3~5 天,加入等量实践菌,过滤。加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器,在最后一次的冲洗液中加入小于100CFU 的实践菌,冲洗。
间接接种法 取适宜间接接种法培养基用量请求恳求的硫乙醇酸盐流体培养基6 管,另1 管作为对照,划分接入小于100CFU 的枯草芽孢杆菌、红色念珠菌、黑曲霉各2 管。其中1 管接入每支培养基轨则的供试品接种量,取适宜间接接种法培养基用量请求恳求的胰酪大豆胨液体培养基6 管,划分接入小于100CFU 的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2 管。
结果判断与对照拂对比,扫除供试品的抑菌作用,应采用增添冲洗量、增添培养基的用量、利用中和剂或灭活剂、调换滤膜品种等措施,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,照此检查措施和检查条件进行供试品的无菌检查。 如含供试品的任一容器中的实践菌生长衰弱、慢慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以疏忽不计,如含供试品各容器中的实践菌均生长良好。
措施适用性实践也可与供试品的无菌检查同时进行。
供试品的无菌检查
无菌检查法包括薄膜过滤法和间接接种法。只须供试品本质允诺。
无菌实践经过中,应证明其有效性,若需利用外面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂。
检验数量 检验数量是指一次实践所用供试品最小包装容器的数量。除另有轨则外。
检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量(g 或ml)。除另有轨则外,供试品检验量按表3 轨则。若每支(瓶)供试品的装量按轨则足够接种两种培养基,只须供试品特性允诺,则应划分接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过滤法时。
阳性对照 应遵循供试品特性拔取阳性对照菌:无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品,加菌量小于100CFU,以红色念珠菌为对照菌。阳性对照实践的菌液制备同措施适用性实践,以生孢梭菌为对照菌;抗真菌的供试品,以金黄色葡萄球菌为对照菌;抗革兰阳性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌;抗厌氧菌的供试品。
阳性对照 供试品无菌检查时,应取相应溶剂和浓缩液、冲洗液同法操作。
供试品解决及接种培养基
操作时,再按无菌操作启开容器取出内容物。除另有轨则外,可用适宜的无菌器材(如带有除菌过滤器的针头)向容器内导入无菌空气,若是供试品容器内有必然的真空度,用适宜的消毒液对供试品容器外面进行完全消毒。
1.薄膜过滤法
薄膜过滤法应采用封锁式薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm。直径约为50mm。遵循供试品及其溶剂的特性拔取滤膜材质。抗生素供试品应拔取低吸附的滤器及滤膜。滤器及滤膜利用前应采用适宜的措施灭菌。利用时。
水溶性供试液过滤前应先将大批的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品,且总冲洗量不获胜过1000ml,每张滤膜每次冲洗量通常为100ml,若须要用冲洗液冲洗滤膜,应注意维系供试品溶液及冲洗液笼盖整个滤膜外面。供试液经薄膜过滤后,其滤膜和过滤器在利用前应充足枯燥。为阐明滤膜的最大过滤效率。
水溶液供试品取轨则量, 2 份滤器加入100ml 硫乙醇酸盐流体培养基,1 份滤器加入100ml 胰酪大豆胨液体培养基。生物制品样品冲洗后,1 份滤器加入100ml 硫乙醇酸盐流体培养基,通常样品冲洗后,所用的冲洗量、冲洗措施同措施适用性实践。除生物制品外,冲洗次数通常不少于三次,须用冲洗液冲洗滤膜,立即过滤。如供试品具有抑菌作用,混匀,或混合至含不少于100ml 适宜浓缩液的无菌容器中,间接过滤。
水溶性固体供试品 取轨则量,加适宜的浓缩液溶解或按标签说明复溶。
非水溶性供试品取轨则量,充足混合,间接过滤;或混合溶于过量含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的浓缩液中。
可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试品 取轨则量,静置,充足振摇萃取,于含有过量的无菌十四烷酸异丙酯中的供试液中加入不少于100ml 的浓缩液,趁热迅速过滤。对仍然无法过滤的供试品,但温度不获胜过44℃,若是须要可适当加热,使供试品充足溶解,剧烈振摇,混合至过量的无菌十四烷酸异丙酯①中。
无菌气(喷)雾剂供试品取轨则量,并将供试液转移至无菌容器中,开释抛射剂后再无菌开启容器,将各容器置-20℃以下的冰室冷冻约1 小时。以无菌操作迅速在容器上端钻一小孔。
装有药物的注射器供试品取轨则量,或混合至含适宜浓缩液的无菌容器中,将注射器中的内容物(若须要可吸入浓缩液或标签所示的溶剂溶解)间接过滤。
具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)供试品 取轨则量,网罗冲洗液于无菌容器中,每个最小包装用50~100ml 冲洗液划分冲洗内壁。
2. 间接接种法
间接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品,胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml。供试品检查时,硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml,同时,每个容器中培养基的用量应适宜接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%,通常样品无菌检查时两种培养基接种的支/瓶数相等;生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2:1。除另有轨则外,即取轨则量供试品划分等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。除生物制品外。
混悬液等非廓清水溶液供试品 取轨则量,等量接种至各管培养基中。
固体供试品 取轨则量,或按标签说明复溶后,间接等量接种至各管培养基中。或加入适宜的溶剂溶解。
非水溶性供试品取轨则量,加入过量的聚山梨酯80 或其它适宜的乳化剂及浓缩剂使其乳化,混合。
敷料供试品 取轨则数量,于不同部位剪取约100mg 或1cm×3cm 的供试品,以无菌操作拆开每个包装。
肠线、缝合线等供试品 肠线、缝合线及其它一次性利用的医用资料按轨则量取最小包装,无菌拆开包装。
灭菌医用器具供试品 取轨则量,必要时应将其分离或切成小碎段。
放射性药品 取供试品1 瓶(支)。
培养及游览
将上述接种供试品后的培养基容器划分按各培养基轨则的温度培养14天;接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分红两等份,镜检,染色,游览接种的同种稀罕培养基能否再表现混浊;或取培养液涂片,培养3 天,可取该培养液过量转种至同种稀罕培养基中,不能从外观上判断有无微生物生长,培养14 天后,培养基表现混浊,一份置20~25℃培养。培养期间应逐日游览并记录能否有菌生长。如在加入供试品后或在培养经过中,一份置30~35℃培养。
结果判断
阳性对照拂应生长良好,除非能充足证明实践结果有效,判供试品不适宜轨则,判供试品适宜轨则;若供试品管中任何一管显混浊并确证有菌生长,或虽显混浊但经确证无菌生长,实践有效。若供试品管均廓清,阳性对照拂不得有菌生长。否则。
(1)无菌检查实践所用的设备及环境的微生物监控结果不适宜无菌检查法的请求恳求。
(2)转头回来无菌实践经过。
(3)供试品管中生长的微生物经鉴定后。
实践若经确认有效,判供试品适宜轨则;若有菌生长,若无菌生长,依法检查,重新取同量供试品,应重试。重试时。


表1 批出厂产品及生物制品的原液和半制品最少检验数量

批出厂产品及生物制品的原液和半制品最少检验数量

注:若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基。

表2. 上市抽验样品的最少检验数量

上市抽验样品的最少检验数量


注:1.若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基。
2.抗生素粉针剂(≥5 克)及抗生素原料药(≥5 克)的最少检验数量为6 瓶(或支)。桶装固体原料的最少检验数量为4 个包装。

表3. 供试品的最少检验量

供试品的最少检验量

注:① 若是医用器械体积过大,培养基用量可在2000ml 以上。

说明:
1.无菌检查法收载于《中国药典》一、二、三部附录中。
2.本稿以2010 年版二部的“无菌检查法”为基础进行中的内容进行一、二及三部内容的整合。
3..整合稿保存了生物制品无菌检查法的特质。
4..订正稿中检验环境订正为“B 级背景下的A 级”。
5.改良马丁培养基订正为“胰酪大豆胨液体培养基”。
6.措施考证实践订正为措施适用性实践。
7.由于培养基的变动。
8.订正了表1、表2、表3 的内容。

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