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非无菌产品微生物限度搜检:担任菌搜检法-2015中国药典


录入时间:2014-9-16 10:36:38 来源:国度药典委员会,新宝GG平台内部主管。

担任菌搜检法系用于在划定的试验条件下。

当本法用于搜检非无菌制剂及其原、辅料是否适应相应的微生物限度尺度时,应按下列划定举行检验。

本搜检法可采用替代的微生物搜检法,包括主动检测要领。

供试液制备及实验环境央求条件同“非无菌产品微生物限度搜检:微生物计数法”(通则1105)。新宝GG平台内部主管。

如果供试品具有抗菌活性,应尽大概去除或中和。新宝GG平台内部主管。供试品搜检时, 若使用了中和剂或灭活剂。

供试液制备时如果使用了外观活性剂。

培养基适用性搜检和担任菌搜检要领适用性试验

供试品担任菌搜检中所使用的培养基应举行适用性搜检。

供试品的担任菌搜检要领应举行要领适用性试验。

若检验程序或产品发生变化大概影响检验结果时。

菌种及菌液制备

菌种试验用菌株的传代次数不得逾越5 代(从菌种保藏主题得到的枯燥菌种为第0 代),并采用适宜的菌种保藏技术举行生存。新宝GG直属

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B)26 003〕,新宝GG主管。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B)10 104〕

大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B)44 102〕,新宝GG代理。

乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC(B)50 094〕,新宝GG登录平台。

红色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F)98 001〕

生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B)64 941〕,新宝GG总代。

菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌差别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上,30~35℃培养18~24 小时;将红色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中。新宝GG平台内部主管非无菌产品微生物限定搜检:担任菌搜检法。,2015中国药典。

菌液制备后若在室温下放置,稳固的孢子悬液可生存在2~8℃,gg。可在24 小时内使用。生孢梭菌孢子悬液可替代稀奇的菌悬液,应在2 小时内使用;若生存在2~8℃。

阳性对照

为确认试验条件是否适应央求条件, 阳性对照试验应无菌生长。平台。如阳性对照有菌生长,应举行阳性对照试验。

培养基适用性搜检

担任菌搜检用的制品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应举行培养基的适用性搜检。,内部。

担任菌搜检用培养基的适用性搜检项目包括促生长能力、克制能力及指示特性的搜检。各培养基的检测项目及所用的菌株见表1。主管。

表1 担任菌搜检用培养基的促生长能力、克制能力和指示特性

液体培养基促生长能力搜检差别接种不大于100cfu 的试验菌(见表1)于被检培养基和对照培养基中,与对照培养基管比力,无菌。在相应担任菌搜检划定的培养温度及不善于划定的最短培养时间下培养。

固体培养基促生长能力搜检用涂布法差别接种不大于100cfu 的试验菌(见表1)于被检培养基和对照培养基平板上,在相应担任菌搜检划定的培养温度及不善于划定的最短培养时间下培养。产品。

培养基克制能力搜检接种不少于100cfu 的试验菌(见表1)于被检培养基和对照培养基中,在相应担任菌搜检划定的培养温度及不短于划定的最长培养时间下培养。微生物。

培养基指示特性搜检用涂布法差别接种不大于100cfu 的试验菌(见表1)于被检培养基和对照培养基平板上,在相应担任菌搜检划定的培养温度及不善于划定的最短培养时间下培养。限定。,搜检。

担任菌搜检要领适用性试验

供试液制备 按下列“供试品搜检”中的划定制备供试液。

试验菌 凭据各品种项下微生物限度尺度中划定搜检的担任菌选择相应考验菌株。

适用性试验按担任菌搜检法取划定量供试液及不大于100cfu 的试验菌接入划定的培养基中;采用薄膜过滤法时,取划定量供试液,过滤,担任。冲洗,试验菌应加在末了一次冲洗液中,搜检。过滤后,注入划定的培养基或取出滤膜接入划定的培养基中。依相应的担任菌搜检要领,在划定的温度及最短时间下培养。

结果判断上述试验若检出试验菌,应祛除供试品的抑菌活性(见非无菌产品微生物搜检:2015。微生物计数法(附录×××)中的“抗菌活性的去除或灭活”),中国。按此供试液制备法和担任菌搜检要领举行供试品搜检;若未检出试验菌。

如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法祛除,可认为受克制的微生物不大概存在于该供试品中。国药。

供试品搜检

供试品的担任菌搜检应按经要领适用性试验确认的要领举行。

阳性对照试验 阳性对照试验要领同供试品的担任菌搜检,对照菌的加量应不大于100cfu。阳性对照试验应检出相应的担任菌。

阳性对照试验以浓缩剂取代供试液照相应担任菌搜检法搜检,阳性对照试验应无菌生长。药典。如果阳性对照有菌生长。

耐胆盐革兰阳性菌(Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria),新宝GG平台内部主管非无菌产品微生物限定搜检:担任菌搜检法。

供试液制备和预培养取供试品,在20~25℃培养,混匀,2015中国药典。用胰酪大豆胨液体作为浓缩剂照“非无菌产品微生物限度搜检:微生物计数法” (通则1105)制成1:10 供试液。

未检出试验

除另有划定外,30~35℃培养18~24 小时。gg。如果平板上无菌落生长,平台。划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上,30~35℃培养24~48 小时后,取相当于1g 或1mL 供试品的上述预培养物接种至肠道菌增菌液体培养基中。

定量试验

选择和分离培养 取相当于0.1g、0.01g 和0.内部。001g(或0.1mL、0.主管。01mL 和0.001mL)供试品的预培养物或其浓缩液差别接种至肠道菌增菌液体培养基中,30~35℃培养24~48 小时。上述每一培养物差别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上。

结果判断若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长,否则为阳性。凭据各培养管搜检结果,则对应培养管为阳性。

表2 耐胆盐革兰阳性菌的大概菌数

注:⑴ +代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长;-代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上无菌落生长。

⑵ 若供试品量裁减10 倍(如0.01g 或0.01ml,0.0001g 或0.0001ml),0.001g 或0.001ml。

大肠埃希菌(Escherichia coli)

供试液制备和增菌培养 取供试品,混匀,接种至适宜体积(经要领适用性试验确定的)的胰酪大豆胨液体培养基中,照“非无菌产品微生物限度搜检:微生物计数法” (通则1105)制成1:10 供试液。取相当于1g 或1mL 供试品的供试液。

选择和分离培养取上述预培养物1mL 接种至100mL 麦康凯液体培养基中,42~44℃培养24~48 小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上。

结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长,或虽有菌落生长但判决结果为阳性,应举行分离、纯化及适宜的判决试验, 确证是否为大肠埃希菌;若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长。

沙门菌(Salmonella)

供试液制备和增菌培养取10g 或10mL 供试品间接或处置惩罚后接种至适宜体积(经要领适用性试验确定的)的胰酪大豆胨液体培养基中,混匀。

选择和分离培养取上述预培养物0.1mL 接种至10mL RV 沙门增菌液体培养基中,30~35℃培养18~24 小时。取少量RV 沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上。

沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上生长良好,培养18~24 小时,菌落为淡红色或无色、透明或半透明、主题有或无黑色。用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面上举行斜面和高层穿刺接种。

结果判断若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长,或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色;或斜面黄色、底层未见黄色黑色,或虽有菌落生长但判决结果为阳性,应进一步举行适宜的判决试验, 确证是否为沙门菌。如果平板上没有菌落生长,或斜面黄色、底层黄色或黑色,且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

供试液制备和增菌培养取供试品,接种至适宜体积(经要领适用性试验确定的)的胰酪大豆胨液体培养基中,照“非无菌产品微生物限度搜检:微生物计数法” (通则1105)制成1:10 供试液。取相当于1g 或1mL 供试品的供试液。

选择和分离培养 取上述预培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上。

取上述平板上生长的菌落举行氧化酶试验。

氧化酶试验将干净滤纸片置于平皿内,用无菌玻棒取上述平板上生长的菌落涂于滤纸片上,滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液。

结果判断若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有菌落生长,或氧化酶试验阳性,或虽有菌落生长但判决结果为阳性,应进一步举行适宜的判决试验, 确证是否为铜绿假单胞菌。如果平板上没有菌落生长,且氧化酶试验阳性。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

供试液制备和增菌培养取供试品,接种至适宜体积(经要领适用性试验确定的)的胰酪大豆胨液体培养基中,照“非无菌产品微生物限度搜检:微生物计数法” (通则1105)制成1:10 供试液。取相当于1g 或1mL 供试品的供试液。

选择和分离培养 取上述预培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上。

结果判断若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外周有黄色环的红色菌落生长,或虽有相符或疑似的菌落生长但判决结果为阳性,应举行分离、纯化及适宜的判决试验, 确证是否为金黄色葡萄球菌;若平板上没有与上述样式特征相符或疑似的菌落生长。

梭菌(Clostridia)

供试液制备和热处置惩罚取供试品,照“非无菌产品微生物限度搜检:微生物计数法” (通则1105)制成1:10 供试液。取相当于1g 或1mL 供试品的供试液2 份。

选择和分离培养将上述2 份供试液差别接种至适宜体积(经要领适用性试验确定的)的梭菌增菌培养基中,差别涂抹接种于哥伦比亚琼脂培养基平板上,置厌氧条件下30~35℃培养48 小时。取上述每一培养物少量。

过氧化氢酶试验 取上述平板上生长的菌落,滴加3%过氧化氢试液,置干净玻片上。

结果判断若哥伦比亚琼脂培养基平板上有带或不带芽孢的厌氧杆菌生长,或过氧化氢酶响应阳性,或虽有相符或疑似的菌落生长但判决结果为阳性,应进一步举行适宜的判决试验, 确证是否为梭菌;如果哥伦比亚琼脂培养基平板上没有厌氧杆菌生长,且过氧化氢酶响应阳性的。

红色念珠菌(Candida albicans)

供试液制备和增菌培养取供试品,混匀,接种到100mL 沙氏葡萄糖液体培养基中,照“非无菌产品微生物限度搜检:微生物计数法” (通则1105)制成1:10 供试液。取相当于1g 或1mL 供试品的供试液。

选择和分离 取上述预培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。

红色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳红色,培养24~48 小时(必要时延伸至72 小时),神色变深、质地变硬或有皱褶。挑取疑似菌落接种至念珠菌显色培养基平板上,偶见淡黄色,外观腻滑有浓酵母气味,培养时间稍久则菌落增大。

结果判断若沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上有疑似菌落生长,或疑似菌在念珠菌显色培养基平板上生长的菌落呈阳性响应,或虽有菌落生长但判决结果为阳性,应进一步举行适宜的判决试验, 确证是否为红色念珠菌;若沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上没有菌落生长,且疑似菌在念珠菌显色培养基平板上生长的菌落阳性响应。

浓缩液

浓缩液配制后,应采用考证合格的灭菌程序灭菌。

1. pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 照无菌搜检法(通则1101)制备。

2. pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液pH7.2 无菌磷酸盐缓冲液pH7.6 无菌磷酸盐缓冲液按缓冲液 照缓冲液(通则8004)配制后,过滤,分装,灭菌。

如必要,可在上述浓缩液灭菌前或灭菌后出席外观活性剂或中和剂等。

3. 0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g,加水溶解使成1000ml,分装,过滤。

培养基及其制备要领

培养基可按以下处方制备,也可使用按该处方生产的适应央求条件的脱水培养基。配制后,应按考证过的高压灭菌程序灭菌。

1.胰酪大豆胨液体培养基(TSB)胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)沙氏葡萄糖液体培养基(SDB) 照无菌搜检法(通则1101)制备。

2、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)

照无菌搜检法(通则1101)制备。如使用含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂培养基。

3、 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)

马铃薯(去皮) 200g 琼脂 14.0g

葡萄糖 20.0g 纯化水 1000mL

取马铃薯,分装,摇匀,出席琼脂,加热溶化后, 再出席葡萄糖,调治pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为5.6±0.2,取滤液补水至1000ml,用6-8 层纱布过滤,煮沸20-30min,加水1000mL,切成小块。

4.玫瑰红钠琼脂培养基培养基

胨 5.0g 玫瑰红钠 0.0133g

葡萄糖 10.0g 琼脂 14.0g

磷酸二氢钾 1.0g 纯化水 1000ml

硫酸镁 0.5g

除葡萄糖、玫瑰红钠外,取上述成分,混合,微温溶解,分装,出席葡萄糖、玫瑰红钠,摇匀。

5、硫乙醇酸盐流体培养基 照无菌搜检法(通则1101)制备

6、肠道菌增菌液体培养基

明胶胰酶水解物 10.0g 二水合磷酸氢二钠 8.0g

牛胆盐 20.0g 亮绿 15mg

葡萄糖 5.0g 纯化水 1000mL

磷酸二氢钾 2.0g

除葡萄糖、亮绿外,取上述成分,混合,微温溶解,加热至100℃ 30 分钟,出席葡萄糖、亮绿,调治pH 值使加热后在25℃的pH 值为7.2±0.2。

7、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基

酵母浸出粉 3.0g 中性红 30mg

明胶胰酶水解物 7.0g 结晶紫 2mg

脱氧胆酸钠 1.5g 琼脂 15.0g

葡萄糖 10.0g 纯化水 1000mL

氯化钠 5.0g

除葡萄糖、中性红、结晶紫、琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调治pH使加热后在25℃的pH 值为7.4±0.2。出席葡萄糖、中性红、结晶紫、琼脂。

8、麦康凯液体培养基

明胶胰酶水解物 20.0g 溴甲酚紫 10mg

乳糖 10.0g 纯化水 1000mL

牛胆盐 5.0g

除乳糖、溴甲酚紫外,分装,出席乳糖、溴甲酚紫,调治pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为7.3±0.2,微温溶解,混合,取上述成分。

9、麦康凯琼脂培养基

明胶胰酶水解物 17.0g 中性红 30.0mg

胨(肉或酪蛋白) 3.0g 结晶紫 1mg

乳糖 10.0g 琼脂 13.5g

脱氧胆酸钠 1.5g 纯化水 1000mL

氯化钠 5.0g

除乳糖、中性红、结晶紫、琼脂外,分装,并不停振摇,加热煮沸1 分钟,出席乳糖、中性红、结晶紫、琼脂,调治pH值使灭菌后在25℃的pH 值为7.1±0.2,微温溶解,混合,取上述成分。

10、RV 沙门菌增菌液体培养基

大豆胨 4.5g 六水合氯化镁 29.0g

氯化钠 8.0g 孔雀绿 36mg

磷酸氢二钾 0.4g 纯化水 1000mL

磷酸二氢钾 0.6g

除孔雀绿外,分装,调治pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为5.2±0.2。出席孔雀绿,微温溶解,混合,取上述成分。

11、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基

酵母浸出粉 3.0g 氯化钠 5.0g

L-赖氨酸 5.0g 硫代硫酸钠 6.8g

木糖 3.5g 枸橼酸铁铵 0.8g

乳糖 7.5g 酚红 80mg

蔗糖 7.5g 琼脂 13.5g

脱氧胆酸钠 2.5g 纯化水 1000mL

除三种糖、酚红、琼脂外,加热至沸腾,出席三种糖、酚红、琼脂,微温溶解,调治pH 值使加热后在25℃的pH 值为7.4±0.2,混合,取上述成分。

12.三糖铁琼脂培养基(TSI)

胨 20.0g 硫酸亚铁 0.2g

牛肉浸出粉 5.0g 硫代硫酸钠 0.2g

乳糖 10.0g 0.2%酚磺酞指示液 12.5ml

蔗糖 10.0g 琼脂 12.0g

葡萄糖 1.0g 纯化水 1000ml

氯化钠 5.0g

除三种糖、0.2%酚磺酞指示液、琼脂外,灭菌,分装,摇匀,再出席其余各成分,加热溶化后,出席琼脂,微温溶解, 调治pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为7.3±0.1,混合,取上述成分。

13、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基

明胶胰酶水解物 20.0g 甘油 10mL

氯化镁 1.4g 琼脂 13.6g

硫酸钾 10.0g 溴化十六烷基三甲铵 0.3g

纯化水 1000mL

除琼脂外,分装,加热煮沸1 分钟,出席琼脂,调治pH 使灭菌后在25℃的pH 值为7.4±0.2,微温溶解,混合,取上述成分。

14、甘露醇盐琼脂培养基

胰酪胨 5.0g 氯化钠 75.0g

植物组织胃蛋白酶水解物 5.0g 酚红 25mg

牛肉浸出粉 1.0g 琼脂 15.0g

D-甘露醇 10.0g 纯化水 1000mL

除甘露醇、酚红、琼脂外,分装,煮沸1 分钟,出席甘露醇、酚红、琼脂,加热并振摇,调治pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为7.4±0.2,微温溶解,混合,取上述成分。

15、梭菌增菌培养基培养基

胨 10.0g 盐酸半胱氨酸 0.5g

牛肉浸出粉 10.0g 乙酸钠 3.0g

酵母浸出粉 3.0g 氯化钠 5.0g

可溶性淀粉 1.0g 琼脂 0.5g

葡萄糖 5.0g 纯化水 1000mL

除葡萄糖外,分装,混匀,调治pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为6.8±0.2。出席葡萄糖,并不停搅拌。如必要,加热煮沸使溶解,混合,取上述成分。

16、哥伦比亚琼脂培养基

胰酪胨 10.0g 玉米淀粉 1.0g

肉胃蛋白酶消化物 5.0g 氯化钠 5.0g

心胰酶消化物 3.0g 琼脂 10.0~15.0g(依凝固力)

酵母浸出粉 5.0g 纯化水 1000mL

除琼脂外,混匀,冷至45~50℃出席相当于20mg 庆大霉素的无菌硫酸庆大霉素,灭菌后,灭菌。如有必要,分装,加热溶化,出席琼脂,调治pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为7.3±0.2,并不停搅拌。如必要,加热煮沸使溶解,混合,取上述成分。

17. 念珠菌显色培养基

胨 10.2g 琼脂 15g

氢罂素 0.5g 灭菌水 1000ml

色素 22.0g

除琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调治pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为6.3±0.2。滤过,不停搅拌至琼脂完全溶解,加热煮沸,出席琼脂。

说明:

1.微生物限度搜检法收载于《中国药典》一、二、三部附录中。

2.本稿是2010 年版微生物限度搜检中“担任菌搜检、培养基预备”的内容订正稿。


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