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非无菌产品微生物限度检讨:微生物计数法-2015中国药典


录入年华:2014-9-16 10:36:19 来源:国度药典委员会,新宝GG平台网址。

微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。

当本法用于检讨非无菌制剂及其原、辅料等能否适合规则的微生物限度轨范时,包括样品的取样量和结果的判断等。新宝GG平台网址。除另有规则外,应按下述规则进行检验。

本检讨法可采用替代的微生物检讨法,包括主动检测方法。

微生物计数尝试应在受控明净环境下的局部明净度不低于B 级的单向流空气区域内进行。检验全进程必需肃静严厉遵守无菌操作,新宝GG平台网址。防止再净化。

如供试品有抗菌活性,应尽可能去除或中和。新宝GG招商。供试品检讨时, 若应用了中和剂或灭活剂。

供试液制备时如果应用了外表活性剂。

计数方法

计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法(Most-Probable-NumberMethod,但看待某些微生物净化量很小的供试品,新宝GG下载。简称MPN 法)。MPN 法用于微生物计数时精确度较差。

供试品检讨时, 应依据供试品理化特性和微生物限度轨范等身分采取计数方法,新宝GG注册。所选的方法必需具备检测充足样品量的能力。

计数培养基适用性检讨和供试品计数方法适用性尝试

供试品微生物计数中所应用的培养基应进行适用性检讨。

供试品的微生物计数方法应进行方法适用性尝试。

若检验程序或产品爆发变化可能影响检验结果时。

表1 尝试菌液的制备和应用

尝试菌株

尝试菌液的制备

计数培养基适用性检讨

计数方法适用性尝试

需氧菌总数

计数

霉菌和酵母

菌总数计数

需氧菌总数

计数

霉菌和酵母

菌总数计数

金黄色葡萄球菌

(Staphylococcus

aureus)

CMCC(B)26 003)

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养,培养温度3035℃,培养年华1824小时

胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基,培养温度30~35℃,培养年华不越过3 天,接种量不大于100cfu

胰酪大豆胨琼脂培养基/胰酪大豆胨液体培养基(MPN 法),培养温度3035℃,培养年华不越过3 天,接种量不大于100cfu

铜绿假单胞菌

Pseudomonas

aeruginosa

CMCCB10 104

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基。3035℃,培养年华1824小时

胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基,培养温度3035℃,培养年华不越过3天,接种量不大于100cfu

胰酪大豆胨琼脂培养基/胰酪大豆胨液体培养基(MPN 法),培养温度3035℃,培养年华不越过3 天,接种量不大于100cfu

枯草芽孢杆菌

(Bacillus

subtilis)

CMCC(B) 63 501

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基。3035℃,培养年华1824小时

胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基,培养温度3035℃,培养年华不越过3天,接种量不大于100cfu

胰酪大豆胨琼脂培养基/ 胰酪大豆胨液体培养基(MPN法),培养温度3035℃,培养年华不越过3 天,接种量不大于100cfu

红色念珠菌

(Candida

albicans)

CMCC(F) 98 001

沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基。2025℃,培养年华23

胰酪大豆胨

琼脂培养基,

培养温度3035℃,培养年华不超5 天,接种量不大于100cfu

沙氏葡萄糖琼脂培养基,培养温度 20~ 25℃,培养年华不越过5天,接种量不大于100cfu

胰酪大豆胨琼脂培养基MPN 法不适用),培养温度3035℃,培养年华不越过5 天,接种量不大于100cfu

沙氏葡萄糖琼脂培养基,培养温度 20 25℃,培养年华不越过5天,接种量不大于100cfu

黑曲霉

(Aspergillus niger)

CMCC(F) 98 003

沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基。2025℃,培养年华57天,或直到取得厚实的孢子

胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度3035℃,培

养年华不超

5 天,接种量不大于100cfu

沙氏葡萄糖琼脂培养基,培养温度 20 25℃,培养年华不越过5天,接种量不大于100cfu

胰酪大豆胨琼脂培养(MPN 法不适用),培养温度3035℃,培养年华不越过5 天,接种量不大于100cfu

沙氏葡萄糖琼脂培养基,培养温度 2025℃,培养年华不越过5天,接种量不大于100cfu

注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时,新宝GG直属。应进行培养基适用性检讨。

菌种及菌液制备

菌种尝试用菌株的传代次数不得越过5 代(从菌种保藏主旨取得的枯燥菌种为第0 代),并采用适宜的菌种保藏技术进行存在。新宝GG招商。

菌液制备 按表1 规则程序培养各尝试菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、红色念珠菌的新奇培养物。pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液;取黑曲霉的新奇培养物参与3~5ml 含0.05%聚山梨酯80 的pH7.新宝GG主管。0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液,新宝GG平台网址。采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,将孢子洗脱。然后。

菌液制备后若在室温下放置,可在24小时内应用。非无菌产品微生物限制反省:微生物计数法。安靖的黑曲霉孢子悬液可存在在2~8℃,应在2 小时内应用;若存在在2~8℃。

阳性对照

为确认尝试条件能否适合哀求, 阳性对照尝试应无菌生长。2015中国药典。如阳性对照有菌生长,应进行阳性对照尝试。

培养基适用性检讨

微生物计数用的制品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检讨。,gg。

按表 1 规则。沙氏葡萄糖琼脂培养基平板,置表1 规则条件下培养。

每一尝试菌株平行制备2 管或2 个平皿。同时。

被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2 边界内,平台。且菌落样子大小应与对照培养基上的菌落一致;被检液体培养基管与对照培养基管斗劲。

计数方法适用性尝试

供试液制备

依据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。台网。供试液制备若需加温时,网址。应均匀加热,且温度不应越过45℃。供试液从制备至参与检验用培养基,不得越过1 小时。

常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用。

水溶性供试品取供试品,或pH7.无菌。2 磷酸盐缓冲液,用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

若须要,调理供试液pH 值至6~8。必要时。

水不溶性非油脂类供试品 取供试品,用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。pH7.2 磷酸盐缓冲液,调理供试液pH 值至6~8。必要时,使供试品分散均匀。产品。若须要,可在浓缩剂中参与外表活性剂如0.1%的聚山梨酯80,或胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10 供试液。分散力较差的供试品。

油脂类供试品取供试品,并在最短年华内酿成乳状液。必要时,微生物。混合,保温,限制。然后参与预热的浓缩剂使成1∶10供试液,若须要可在水浴中进行,反省。留神混合,最多不越过45℃),或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80 或其他无抑菌性的无菌外表活性剂充满混匀。外表活性剂的温度平常不越过40℃(卓殊情况下,参与经过滤除菌的十四烷酸异丙酯使溶解。

需用卓殊方法制备供试液的供试品

膜剂供试品取供试品,剪碎,加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,微生物。调理供试液pH 值至6~8。必要时,制备成1∶10 的供试液。计数。若须要,振摇,浸泡,或胰酪大豆胨液体培养基,或pH7.2磷酸盐缓冲液。

肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品,置45℃水浴中,振摇,使溶解,2015。制备成1∶10 的供试液。必要时,参与pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7.6 无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)。

气雾剂、喷雾剂供试品取供试品,置冰冻室冷冻约1 小时,使抛射剂慢慢全部释出。中国。用无菌注射器从每一容器中吸出全部药液于无菌容器中混合,并轻轻转动容器,国药。放至室温,用无菌钢锥在该部位钻一小孔,迅速消毒供试品开启部位,取出。

贴膏剂供试品取供试品,去掉防粘层,振荡至多30 分钟。药典。必要时,防止贴膏剂粘贴在一起。新宝GG平台网址。将经管后的贴膏剂放入盛有适宜体积并含有外表活性剂(如聚山梨脂80 或卵磷脂)浓缩液的容器中,在粘贴面上掩盖一层适宜的无菌多孔原料(如无菌纱布),将粘贴面朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上。

接种和浓缩

按下列哀求进行供试液的接种和浓缩,制备微生物回收尝试用供试液。非无菌产品微生物限制反省:微生物计数法。所加菌液的体积应不越过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充满检出。

(1) 尝试组 取上述制备好的供试液,混匀,参与尝试菌液。

(2) 供试品对照组 取制备好的供试液, 以浓缩液庖代菌液同尝试组操作。

(3)菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应浓缩液替代供试液,按尝试组操作参与尝试菌液并进行微生物回收尝试。2015中国药典。

若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因招致无法采取最低浓缩级的供试液进行方法适用性尝试时,应采用适宜的方法对供试液进行进一步的经管。gg。如果供试品对微生物生长的遏抑作用无法以其他方法取消。

抗菌活性的去除或灭活供试液接种后,按下列“微生物回收”规则的方法进行微生物计数。平台。若尝试组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌数值的50%。

⑴ 扩展浓缩液或培养基体积。

⑵ 参与适宜的中和剂或灭活剂。

中和剂或灭活剂(表2)可用于取消抗菌剂的抑菌活性,即取相应量浓缩液替代供试品同尝试组操作,台网。尝试中应设中和剂或灭活剂对照组,网址。 最好在浓缩剂或培养基灭菌前参与。若应用中和剂或灭活剂。

表2 罕见骚扰物的中和剂或灭活方法


⑶ 采用薄膜过滤法。

⑷ 上述几种方法的联合应用。

若没有适宜取消供试品抑菌活性的方法,供试品也可能仅对特定尝试菌株具有遏抑作用,同时也注明供试品不可能被该类微生物净化。但是,注明供试品对该尝试菌具有抗菌活性,对特定尝试菌回收的腐臭。

于是,应采用能使微生物生长的更高浓缩级的供试液进行计数方法适用性尝试。若方法适用性尝试适合哀求,在不影响检验结果判断的前提下,依据供试品须适合的微生物限度轨范和菌数通知规则。

供试品中微生物的回收

表1 所列的计数方法适用性尝试用的各尝试菌应逐一进行微生物回收尝试。

微生物的回收可采用平皿法、薄膜过滤法或MPN 法。

平皿法平皿法包括倾注法和涂布法。表1 中每株尝试菌每种培养基至多制备2 个平皿。

倾注法取照上述“供试液的制备”、“接种和浓缩”和“抑菌活性的中和或取消”制备的供试液1ml,凝固,混匀,置直径90mm 的无菌平皿中, 注入15~20ml 温度不越过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基。

若应用直径较大的平皿。

同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各尝试组的平均菌落数。

涂布法取15~20ml 温度不越过45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基,采用适宜的方法使培养基外表枯燥。若应用直径较大的平皿,制成平板,凝固,注入直径90mm 的无菌平皿。

薄膜过滤法 薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于 0.45μm,直径平常为50mm,若采用其他直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。采取滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充满被截留。滤器及滤膜应用前应采用适宜的方法灭菌。应用时,应保证滤膜在过滤前后的完美性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品,其滤膜和滤器在应用前应充满枯燥。为阐扬滤膜的最大过滤效率,应注意维系供试品溶液及冲洗液掩盖整个滤膜外表。供试液经薄膜过滤后,若须要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不得越过1000ml,以防止滤膜上的微生物受损伤。

取照上述 “供试液的制备”、“接种和浓缩”和“抑菌活性的中和或取消”制备的供试液过量(平常取相当于1g、1ml 或10cm2 的供试品, 若供试品中所含的菌数较多时,供试液可酌情减量)。

若测定需氧菌总数。

若测定霉菌和酵母总数。

按表1 规则条件培养、计数。每株尝试菌每种培养基至多制备一张滤膜。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。

MPN 法MPN 法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法,本法不适用于霉菌计数。若应用MPN 法,仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下应用。

取照上述 “供试液的制备”、“接种和浓缩”和“抑菌活性的中和或取消”制备的供试液至多3 个连续浓缩级,每一浓缩级取3 份1ml 不同接种至3 管装有9~10ml 胰酪大豆胨液体培养基中。

接种管置30~35℃培养3 天,在肖似条件下培养1~2 天,可将该管培养物转种至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基,逐日观察各管微生物生长情况。如果由于供试品的原因使得结果难以判断。

表3 微生物最可能数检索表


注:表内所列检验量如改用1g(或ml)、0.1g(或ml)和0.01g(或ml)时,表内数字应相应扩展10 倍,表内数字应相应消沉10 倍;如改用0.01 g(或ml)、0.001 g(或ml)和0.0001 g(或ml)时。

结果判断

计数方法适用性尝试中,尝试组菌数应在菌液对照组菌数的95%相信限内。若各尝试菌的回收尝试均适合哀求,尝试组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5~2 边界内;采用MPN法,采用薄膜过滤法或平皿法时。

方法适用性确认时,若采用上述方法还存在一株或多株尝试菌的回收达不到哀求,那么采取回收最接近哀求的方法和尝试条件进行供试品的检讨。

供试品检讨

检验量

检验量即一次尝试所用的供试品量(g、ml 或cm2)。

除另有规则外,平常供试品的检验量为10g 或10ml;膜剂为100cm2;珍贵药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时,应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品,大蜜丸还不得少于4 丸,膜剂还不得少于4 片。

平常应随机抽取供试品,混合,取规则容器数。

供试品的检讨

按计数方法适用性尝试确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数;沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。

阳性对照尝试 以浓缩剂庖代供试液进行阳性对照尝试,阳性对照尝试应无菌生长。如果阳性对照有菌生长。

平皿法

平皿法包括倾注法和涂布法。除另有规则外,按方法适用性尝试确认的方法进行供试液制备和菌数测定,取规则量供试品。

培养和计数 除另有规则外,按菌数通知规则通知菌数。若同浓缩级两个平皿的菌落数平均值不小于15,计算各浓缩级供试液的平均菌落数,必要时可适当耽误培养年华至7 天进行菌落计数并通知。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落数后, 观察菌落生长情况,点计平板上生长的所有菌落数,沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20~25℃培养5 天,胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30~35℃培养3天。

菌数通知规则 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的浓缩级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu 的浓缩级,作为菌数通知(取两位有用数字)的依据。取最高的平均菌落数。2 供试品中所含的微生物数。

如各浓缩级的平皿均无菌落生长,但平均菌落数小于1 时,或仅最低浓缩级的平板有菌落生长。

薄膜过滤法

除另有规则外。2供试品的供试液,冲洗后取出滤膜,冲洗,立即过滤,照方法适用性尝试确认的方法加至过量浓缩液中,可取适宜浓缩级的供试液,若供试品所含的菌数较多时。

培养和计数 培养条件和计数方法同平皿计数法。

菌数通知规则 以相当于 1g、1ml 或10cm2 供试品的菌落数通知菌数;若滤膜上无菌落生长。2 供试品),或﹤1 乘以最低浓缩倍数的值通知菌数。

MPN 法

取规则量供试品,按方法适应性尝试确定的方法进行。记实每一浓缩级微生物生长的管数,如果须要确认能否有微生物生长,所有尝试管在30~35℃培养3~5 天,按方法适用性尝试确认的方法进行供试液制备和供试品接种。

结果判断

需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数(包括真菌菌落数);霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数(包括细菌菌落数)。若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不适合微生物限度哀求,应进行培养基适用性检讨。若采用MPN 法,可应用含抗生素(如氯霉素、庆大霉素)的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他采取性培养基(如玫瑰红钠琼脂培养基)进行霉菌和酵母菌总数测定。应用采取性培养基时。

各品种项下规则的微生物限度轨范解释如下:

101cfu: 可领受的最大菌数为20;

102cfu: 可领受的最大菌数为200;

103cfu: 可领受的最大菌数为2000:依此类推。

若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检讨结果均适合该品种项下的规则,判供试品适合规则;若其中任何一项不适合该品种项下的规则。

浓缩液、冲洗液及培养基

见非无菌产品微生物限度检讨:控制菌检讨法(通则1106)

无菌检讨法系用于检讨药典哀求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种能否无菌的一种方法。若供试品适合无菌检讨法的规则,仅注明了供试品在该检验条件下未出现微生物净化。

说明:

1.微生物限度检讨法收载于《中国药典》一、二、三部附录中。

2.本稿是2010 年版微生物限度检讨中“细菌、霉菌、及酵母菌计数”的内容订正稿。


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